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科学网FlowJo软件荧光补偿正文

类别:女生头像 | 点击: | 日期:2020-12-04

在做多色流式实验的时候,荧光补偿是必需必须进行的步骤。FlowJo可以根据荧光补偿单染对照管的数据生成补偿矩阵,并可以对补偿矩阵进行调整。


一、用FlowJo做荧光补偿并进行数据分析的步骤

1.在补偿编辑器中导入单染管的数据并生成荧光补偿矩阵

2.将补偿矩阵应用到组,对组里面的所有数据进行荧光补偿

3.对补偿过的参数轴启用双指数转换功能


二、FlowJo荧光补偿的具体步骤

如果荧光补偿单染对照的数据很好,阴性细胞群和阳性细胞群的分群很明显,只需要将单染管的数据导入FlowJo的补偿编辑器里,FlowJo能自动设门,界定出阴性细胞群和阳性细胞群,并计算出荧光补偿矩阵。操作非常简单,下面的4个步骤便可完成荧光补偿:

1.将数据拖入FlowJo工作台。

演示数据为:3 color comp数据,为三色实验的数据。Cy5PE comp.fcs, FITC comp.fcs, PE comp.fcs为单染对照管数据;3-COLOR.FCS为样本数据,同时染了Cy5PE, FITC, PE

 

科学网FlowJo软件荧光补偿

2.到工作台菜单栏的“窗口”栏选择“打开补偿编辑器”,打开后如下图所示。点击单染管对应的Sample列,在弹出的下拉列表中选择对应的单染管数据。比如在下图的例子中,在Flour单染管中导入FITC comp.fcs

 

科学网FlowJo软件荧光补偿

3.按照步骤2中的方法,在3个单染管中都导入对应的数据之后,FlowJo能自动进行设门,界定出阳性细胞群和阴性细胞群,并计算出荧光补偿矩阵。如下图所示:

 

科学网FlowJo软件荧光补偿

4.将补偿矩阵应用到所有样本进行荧光补偿:在工作台的组空间中选中需要进行荧光补偿的组,到补偿编辑器的菜单栏中选择“补偿  > 添加到组”,

 

科学网FlowJo软件荧光补偿

对该组的所有数据进行荧光补偿,补偿过的数据前面带有

科学网FlowJo软件荧光补偿

标志,如下图所示:

 

科学网FlowJo软件荧光补偿


如果某个单染管的数据不是很理想(poor control ),FlowJo不能自动界定出阴性细胞群和阳性细胞群,比如下面的实例:

操作步骤:

1.按照上面的步骤1,2,3操作之后,出现的情况如下:FlowJo没能自动界定出PE单染管的阴性细胞群和阳性细胞群。

 

科学网FlowJo软件荧光补偿

1.1 单击选中工作台样本空间中PE单染管下的cw_Size节点,将其删除

1.2 右键单击补偿编辑器中的单染管出,点击“Clear”,将错误添加进去的单染管数据清除,如下图所示:

 

科学网FlowJo软件荧光补偿

2.将错误界定的细胞群以及错误添加到补偿编辑器的数据清除之后,我们需要自己手动设门,界定出单染管的阴性细胞群和阳性细胞群,并手动将其添加到补偿编辑器。按以下步骤操作:

2.1 在工作台样本空间中双击PE单染管,在FSC/SSC点图中,界定出目标细胞群(淋巴细胞)

 

科学网FlowJo软件荧光补偿

2.2 双击淋巴细胞群,打开图形窗口,X轴选择PhyEry::aCD8,Y轴选择Histogram ,选择区域门工具,界定出PE阳性和PE阴性细胞群,如下图所示:

 

科学网FlowJo软件荧光补偿

                         

        备注:

        a.在设门的时候,选择区域门工具,阴性门和阳性门尽量设在细胞群分布的中心区域

        b.如果单染管的直方图没有明显的双峰,在设门的时候,阴性门和阳性门之间的距离应尽可能远一些

2.3 将工作台样本空间的“PE-”节点拖到补偿编辑器里PE单染管的阴性孔,“PE+”节点拖到阳性孔里

科学网FlowJo软件荧光补偿

 

3.当所有单染管的数据都被添加到补偿编辑器后,FlowJo自动计算出补偿矩阵。在工作台组空间中选择3-color comp组,然后到补偿编辑器的菜单栏中选择“补偿  > 添加到组”,对该组的所有样本进行荧光补偿。

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